篇三：大连理工大学 生化实验报告——模版(新)
小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、
SDS-PAGE电泳法测定蛋
摘要 本实验通过从小牛肠中提取小牛肠碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，并测定酶的活性。最后通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量.
关键词 小牛肠碱性磷酸酶提取 酶活测定 考马斯亮蓝法 SDS-PAGE电泳法
本实验分为三部分。先通过对牛小肠内膜的刮取，离心，沉淀析出等方法，提取牛小肠碱性磷酸酶；然后用考马斯亮蓝G-250与碱性磷酸酶结合，利用紫外分光光度计在一定波长下测定结合物的吸收波长，根据其吸光度与蛋白质结合物的含量成正比的关系测定蛋白质含量，进而测定出蛋白质的比活力；最后，通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定
1、 试剂
（1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）
（2）1mol/L醋酸（HAC）、1mol/LNaOH、硫酸铵
（3）平衡缓冲液：0.01mol/LTris-HCL,PH 8.0,(含1.0×10-3mol/LMgCl2和1.0×10-5mol/LZnCl2)。
（4）底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液（PH9.8，含0.5×10-3mol/LMgCl2）。
（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。（已加入底物缓冲液中）
2、仪器
匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿
1.1.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
1、试剂
考马斯亮蓝、实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定所得酶液、生理盐水
2、仪器
分光光度计、分析天平、玻璃比色杯、试管及试管架、移液枪
1.1.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
1、试剂
1）30%丙烯酰胺（acrylamide,Acr）置棕色瓶。
2）分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。
3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH6.8，已加入10%SDS。
4）10%过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基，须新鲜配置。）
5）TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
6）上扬缓冲液（小离心管装S）：称100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，加0.1mL巯基乙醇、2mL-。-5mol/LpH8.0Tris-HCL,加超纯水定容至10mL。
7）染色液：配置含0.1%考马斯亮蓝R250,40%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。
8）脱色液：500mL10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000mL。
9）电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/LTris，0.384mol/L甘氨酸pH8.3）.
2、仪器
电泳仪、电泳槽、制胶板、摇床、移液枪
1.2 实验过程
1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定
1、酶的分离提纯
1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮去小肠内粘膜，放到盘子一角。
2）统一将小肠黏膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆15s，重复20次。
3）缓慢加入（总体积）1倍体积的冰冷正丁醇，高速匀浆15s，重复20次。
每组领取60mL的匀浆液，放入离心管中（离心管装液量不能超过70%），用另一离心管用水配平（切记离心前连同离心管盖子一起用天平配平），在4℃条件下，10000rpm，离心15min（离心管对称放置）。
4）用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层（勿摇），去下层水相，用1mol/LHAc调pH到
4.9。4℃，10000rpm，离心10min。
5）得到上清26.5mL，放入离心管中，用1mol/LNaOH调pH至6.5，称取质量为溶液体积5%的硫酸铵1.33g(5g硫酸铵/100mL溶液)，加到离心管中溶解；再加0.47倍体积（12.45mL）冰冷丙酮，混匀，4℃（冰箱中）静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。
6）上清液36.5mL中加入1.07倍体积（39.06mL）冰冷丙酮，4℃静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。
7）取沉淀溶于2mL平衡缓冲液至全部溶解。置冰箱保存待用。
2、底物处理
底物（对硝基苯磷酸二钠已溶于平衡缓冲液中）37℃水浴5min（注意：根据分光光度计使用情况，要检测前加热）
3、酶活检测
1）将酶稀释10倍（配制取10μL，溶于90μL平衡缓冲液中得到）
2）紫外分光光度计检测条件：405nm波长，测定时间60s，取值2s，记录范围0.0-1.5。
3）取2个2mL比色皿（0.5cm光程），加入1.5mL上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。
4）将稀释10倍的酶液10μL加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定没动力学曲线。
1.2.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
1、玻璃试管中加入5mL考马斯亮蓝。
2、在1.5mL离心管中，取上一实验得到的酶液分别稀释50、100、200倍。
3、各取100μL加入到5mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上，另各取100μL生理盐水分别加入到5mL考马斯亮蓝试管中。（观察蓝色，以浅蓝色为好）
4、紫外分光光度计检测条件：595nm波长
5、取2个比色皿（1cm光程）加入考马斯亮蓝（比色皿的2/3），分光光度计中校对归零。
6、将样品放入外侧比色皿中，读吸光值（得到医治蛋白浓度标准曲线范围内的度数即可，0.1-0.5之间）。
7、根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度（乘以相应稀释倍数即得原始酶液蛋白浓度，注意单位）
1.2.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
1、装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条（棱朝上，平铺），用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子（注意下面2个夹子要水平，两侧夹子离梳子底部1-0.5cm，表明分离胶加的位置），垂直放置在水平台面上
备用。
2、制备分离胶：在小烧杯中按下表配置所需浓度的分离胶。
分离胶制备（浓度10%，制备量10mL）
试剂
H2O 30%丙烯酰胺
1.5mol/LTris-HCL缓冲液pH8.8
10%过硫酸铵
TEMED 用量 4.1mL 3.4mL 2.4mL 100μL 10μL
注意：最后加入TEMED，应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓慢注胶，然后再用移液枪慢慢移动注入乙醇200μL，以防止氧气进入胶内。15min后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。
3、制备凝缩胶：在小烧杯中按下表配置所需浓度的浓缩胶。
浓缩胶制备（浓度5%，制备量6mL）
试剂
H2O 30%丙烯酰胺
0.5mol/LTris-HCL缓冲液pH6.8
10%过硫酸铵
TEMED
进入气泡，放置约20min，待浓缩胶凝固。
4、蛋白质样品处理（小离心管装B）：在1.5mL离心管中按1:1体积比例，加样品和上样缓冲液（200μL:200μL）。100℃加热3min使蛋白变性。
5、浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子（注意不要产生气魄，即电泳泳道），将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液（内、外槽，查漏），缓冲液高过玻璃板凹面。
6、用移液枪依次在泳道加样(5个20μL，4个40μL)。（本组将marker置于第六泳道）
7、电泳：连接正、负极，打开电源（稳压130V或电流50-60mA），开始时，电流控制在40A，样品进入分离胶后，缓慢升高电压至140V或电流50-60mA保持电压或电流强度不变。带溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳，需1.5h左右。
8、剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，用金属片从玻璃两侧轻轻撬开。使板内进入空气，同时用水冲洗，取出凝胶板，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中。加染色液，至摇床染色15min。
9、脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换1次脱色液，脱色至背景清晰。
10、观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。
11、拍照电泳结果，用于完成实验报告。
用量 3.4mL 1.0mL 1.5mL 60μL 8μL 注意：一旦加入TEMED，应快速摇匀浓缩胶，在已凝固的分离胶层上加浓缩胶，立即将梳子插入胶液顶部，避免
2 结果与讨论
2.1 小牛肠碱性磷酸酶的酶活测定
碱性磷酸酶酶活定义：在37℃条件下，以每分钟催化水解1μmol底物的酶量为一个酶活力单位。
碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水稀释放出对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。
酶活力的计算：
比活力（U/mg）= ΔA/min×VR×DE405×VE×C×L
1、由实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定中实验步骤可知，
反应液的体积VR= 1.5mL
稀释倍数 D= 10
405nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数E405= 18.3L/(mol×cm)
所加酶液体积VE= 0.01mL
比色皿光程 L= 0.5cm
2、405nm波长下的吸光值的变化率通过分光光度计测量得到酶动力学曲线（图1）可以得到，ΔA/min=0.6179 (根据图片，自己估算斜率，注意单位。)
/看后删除
说明： 图片均要用自己的。
半栏图片宽为8.15厘米，高为4.4~5.5厘米之间，对于特别大的图可加大宽度。通栏图片宽度为16.3厘米，高为4.4~5.5厘米之间，图说为字号为小5号黑体字。
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表注用小5号字，表字用6号字。
图1.酶动力学曲线
3、蛋白质原始浓度C可由实验考马斯亮蓝法测定蛋白质含量获得
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于燃料结合法的一种。在一定蛋白浓度范围内（0.01-1.0mg/mL）,蛋白质-色素结合物在
595nm
波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测量。
通过实验，利用紫外分光光堆积测定稀释50倍的酶液读得吸光值为0.1478A，利用考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线（图2）及其标准曲线拟合解析式y=0.697x-0.007得稀释后的标准蛋白浓度为0.2221mg/mL。
故蛋白质原始浓度C=50×0.2221mg/mL=11.105mg/mL
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