自噬的分子标志物研究论文(2)

　　2 CMA 的标志物

　　CMA 是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70 (heat shock cognate protein of 70 kDa,HSC70) 识别, 并将其运送到溶酶体膜上, 再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a 结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程。与大自噬和小自噬相比,CMA 的主要特点是细胞质内的'蛋白质直接经溶酶体膜蛋白转运入溶酶体腔, 不需形成自噬囊泡。

　　2.1 HSC70

　　HSC70 是分子质量为70 kDa 的热休克同源蛋白,它是分子伴侣, 在胞浆识别带有KFERQ 样序列的CMA 底物。HSC70 与定位于溶酶体腔面的Hsp90 相互作用。在HSC70 的帮助下, 底物在穿越溶酶体膜时开始从折叠状态去折叠, 并在LAMP-2a 复合物形成之前完成。将底物转运穿越溶酶体膜还需要定位在溶酶体膜上的HSC70 (lys-HSC70)。HSC70 的稳定性依赖于溶酶体的pH 值。pH 值轻微的上升都会促进HSC70 的降解。

　　2.2 LAMP-2a

　　LAMP-2 有3 个亚型, LAMP-2a、LAMP-2b 和LAMP-2c, 借助RNAi 技术显示只有LAMP-2a 才是CMA 途径重要的受体。CMA 的速率直接依赖于溶酶体膜上LAMP-2a 的含量。LAMP-2a 在胞内的水平可由于转录水平改变或降解速率改变而发生变化。抑制LAMP-2a 将引起CMA 底物GAPDH 的聚集; 过表达LAMP-2a, 则引起GAPDH 水平下降。

　　3 线粒体自噬标志物

　　线粒体自噬指在ROS、营养缺乏和细胞衰老等内外环境的刺激下, 细胞内的线粒体发生去极化, 而这些被损伤的线粒体将被特异性地包裹进自噬体中并与溶酶体融合, 从而完成损伤线粒体的降解, 维持细胞内环境稳定的过程。细胞主要通过选择性自噬来进行线粒体的更新。损伤的线粒体在发生线粒体自噬之前先发生动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介导的线粒体分裂。线粒体膜电位的下降引起PTEN 诱导假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-inducedputative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接着招募E3 泛素连接酶Parkin 到线粒体。Parkin 促进线粒体膜上蛋白质泛素化, p62 蛋白与线粒体上泛素化蛋白相互作用,借助p62 与LC3 的互作引导线粒体被自噬体包裹。同时, 线粒体上存在自噬受体如BNIP3 (Bcl-2 andadenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/BNIP3L (BNIP3-like) 也可以与LC3 互作使得受损线粒体通过自噬方式被去除。研究中通常用线粒体标志物和自噬标志物LC3共定位来显示线粒体自噬。此外, 还有几个线粒体自噬受体也可以考虑用作线粒体自噬的标志。

　　3.1 Atg32

　　酵母中, Atg32 是一个分子质量约59 kDa 的跨膜蛋白, 定位在线粒体外膜上。在氨基端有与Atg8 和Atg11 结合的结构域, 在线粒体自噬的发生中作用巨大。Atg11 是个脚手架蛋白, 在选择性自噬中为Atg蛋白的装配提供平台。羧基端可能发挥调节线粒体自噬的作用。抑制Atg32 表达会减少线粒体自噬的效率,同样地, 过表达Atg32 则增加线粒体自噬的效率。研究认为Atg32 是酵母线粒体自噬发生的限速步骤。进一步的研究发现酵母中Atg32 缺失并不明显影响普遍意义上的自噬, 因此认为Atg32 是引导线粒体自噬专属分子。尽管线粒体自噬是进化上保守的现象,但是在哺乳动物细胞中并未发现Atg32 的同源基因。

　　3.2 BNIP3 和NIX

　　BNIP3 和NIX 序列上有56% 的同源度, 且都有BH3 结构域, 并与Bcl-2 作用。NIX 与BNIP3 定位在线粒体和内质网上, 通过影响线粒体呼吸和ROS 水平调节凋亡和程序性坏死。BNIP3 插入线粒体的外层膜,其氨基端在胞浆中, 而羧基端在线粒体内。BNIP3 诱导线粒体嵴消失并促进细胞色素C 释放, 同时, NIX和BNIP3 包含有与LC3 结合的LC3 相互作用区域(LC3-interaction region, LIR), 因而也被称为是线粒体自噬受体。BNIP3 的17 位丝氨酸和24 位丝氨酸的磷酸化会促进其与LC3 结合, 易化线粒体自噬的发生。NIX 与Ras 家族小GTPase—Rheb 互作促进线粒体自噬。此外, NIX 可促进Parkin 定位到受损线粒体上, Parkin 又对线粒体膜上蛋白质进行泛素化, 从而引导p62 与LC3 的互作而发生线粒体自噬。

　　4 小结

　　自噬标志物的检测在自噬研究中发挥了巨大的作用, 使得人们可以简便、动态、实时并定量地检测细胞内自噬水平。然而单独检测每一种自噬标志物都有一定的局限性和影响因素, 在研究自噬时必须慎重考虑研究条件, 适当设置阴性与阳性对照, 使用多种自噬抑制剂或者基因沉默等技术, 多方面、多层次进行实验以确认细胞的自噬水平。

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