实验计划书范文(5)

篇五：实 验 计 划 书

　　实 验 计 划 书

　　题目：巴氏杆菌的分离及鉴定实验方案

　　组数：第三组

　　组长：李扬帆

　　组员：苏晓娟 王逸涵 海旭南 孙春亮 刘长宝 刘珊 陈红 刘明超 卢宁 年级：08级

　　专业：动物医学专业

　　实验目的：

　　(1)掌握多杀性巴氏杆菌分离的基本要领和方法

　　(2)掌握多杀性巴氏杆菌培养的原理和方法

　　(3)掌握有关多杀性巴氏杆菌的生化试验

　　(4)通过多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定，掌握大肠杆菌的分离和鉴定程序，由此推广到生产实践的应用中去。

　　试剂：

　　琼脂、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、氯化钠、吲哚试剂、草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%酒精，石炭酸复红，蒸馏水，生理盐水，二甲苯，香柏油，1%中性红水溶液，无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血，靛基质试剂，3%过、胆盐、枸橼酸盐、蔗糖、酵母膏、硫代硫酸钠、0.4%酚红水溶液、磷酸氢二钾 实验器材：

　　灭菌的手术刀，镊子，刀片，玻璃皿、染液缸、接种环、试管夹、载玻片、擦镜纸、滤纸、显微镜、酒精棉、超净工作台、恒温箱、高压灭菌锅、试管、培养皿、接种针、漏斗、铁架台、玻璃棒等。

　　病料采集：

　　取巴氏杆菌致死的小鼠,腹部向上固定于蜡盘上，用酒精棉球消毒体表，打开腹腔，暴露肝脏，用剪刀在火焰烧灼灭菌，在肝脏表面烫之杀死表面杂菌，随即在灼烧部位刺一小孔，用灭菌接种环深入灼烧部位小孔中，将接种棒轻轻旋转2次，借以达到取足采料的目的。

　　涂片染色镜检：

　　美兰染色： 巴氏杆菌致死的小鼠，肝脏或脾脏触片，或心血涂片，以碱性美兰液或瑞氏染色液染色，如发现典型的两极着色的短杆菌

　　革兰氏染色：巴氏杆菌致死的小鼠，肝脏或脾脏触片，或心血涂片，革兰氏染色阴性

　　分离培养鉴定：

　　增菌培养：

　　血清肉汤培养基：在血清肉汤中培养，开始轻度浑浊，4-6d后液体变清朗，管底出现黏稠沉淀，振摇后不分散，表面形成菌环。

　　分离培养：

　　①取巴氏杆菌致死的小鼠,腹部向上固定于蜡盘上，用酒精棉球消毒体表，打开腹腔，暴露肝脏，用剪刀在火焰烧灼灭菌，在肝脏表面烫之杀死表面杂菌，随即在灼烧部位刺一小孔，用灭菌接种环深入灼烧部位小孔中，将接种棒轻轻旋转2次，借以达到取足采料的目的。

　　②在血液平板上划线培养，37℃培养24h，观察菌落形态、大小、溶血状况等。多杀性巴氏杆菌在血液平板上长成淡灰色、圆形、湿润、露珠样小菌落。 ③挑取疑似菌落4-6个：分别作以下实验

　　Ⅰ用血琼脂平板进行分离培养，血液平板上长成淡灰色、圆形、湿润、露珠样小菌落，无溶血现象, 革兰氏染色为阴性球杆菌

　　Ⅱ用麦康凯琼脂进行分离培养，麦康凯培养基上不生长

　　Ⅲ将此菌接种在三糖铁培养基上可生长，并使底部变黄。

　　④多杀性巴氏杆菌的纯培养

　　细菌生化试验：

　　（1）甲基红试验（MR试验）：

　　原理：细菌分解葡萄糖产酸，使培养液呈酸性，滴加甲基红试剂呈红色。 方法：细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基

　　结果：阳性反应：呈红色 阴性反应：无变化

　　（2）吲哚试验（靛基质试验）

　　原理：细菌分解色氨酸产生靛基质，与靛基质试剂结合形成红色的化合物而呈色。 方法：细菌接种于蛋白胨水培养基，37℃培养2－3天，沿试管壁缓慢加入靛基质试剂，静置5分钟，观察结果

　　结果：阳性反应：红色环状物 阴性反应：无变化

　　（3）氧化酶试验：阳性

　　加2-3滴试剂于滤纸上，用牙签挑去一个菌落到纸上涂布，观察菌落的反应。阳性反应在5-10s内有粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。 用95%酒精配制的1%的

　　（4）触酶试验：阳性

　　将3%过氧化氢在载玻片上，挑菌观察有无气泡产生即可。阳性反应者有气泡，无则为阴性。

　　（5）VP试验：阴性

　　取24h的纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置于37℃培养48-72小时，取出后在培养基中先加入VP试剂甲液0.6ml，再加入乙液0.2ml。静止在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性。

　　（6）糖发酵试验：

　　原理：细菌分解糖产酸使培养液呈酸性，指示剂表现呈色反应。

　　方法：细菌接种于糖发酵管内，37℃培养24小时，观察结果。结果观察：培养基为黄色者，记为+;变黄且产气泡者，记为（+）;否则记为-

　　葡萄糖发酵管，乳糖发酵管，蔗糖发酵管，果糖发酵管，麦芽糖发酵管，各两个 结果：阳性反应：从蓝紫色变为黄色 阴性法应：仍呈蓝紫色

　　（7）明胶穿刺试验：

　　取纯培养物穿刺接种至半固体琼脂培养基，穿刺线应在培养基中间，直至管底，拔出时应原路返回。结果说明：若该菌有鞭毛，能运动，则部分或全部半固体琼

　　脂变浑浊。不运动者只在穿刺线上生长。

　　（8）抑菌试验

　　取菌，用棉签用棉签致密接种于血清琼脂平板上，用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，各片距离要相等。37度培养24h，观察结果。 血清学鉴定

　　毒力因子检测及抗原鉴定：

　　取纯培养物用0.5%氯化钠溶液洗下制成浓菌液，并分成2份。一份经100度加热1小时（如仍有不凝集性，则在121度下处理2小时）。另一份用0.5%福尔马林37度作用24~48小时。分别用各种抗O血清和抗OK血清对上述菌液做玻板凝集实验。如该菌株含K抗原，则各种抗O血清不能使福尔马林处理的菌液凝集，但可被各种抗OK血清中的一种凝集。经100度或者121度加热的菌液可被一种抗O血清凝集，但可能与别的抗O血清发生交叉凝集，可用试管凝集法按凝集效价来排除。H抗原一般不做鉴定。

　　试验项目分配