摘要：文章综述了基因工程在林木抗寒方面的研究进展， 包括结构基因、顺式作用元件、转录因子和转基因技术。
关键词：基因工程； 林木； 抗寒；
逆境会伤害植物， 严重时会导致死亡。当温度下降到0℃以下时， 植物体内发生冰冻， 因而受伤甚至死亡， 这种现象称为冻害。树木在生长期中如遇到温度的突然变化， 会打乱植物生理进程的程序而造成伤害， 迄今为止， 尚没有解决低温冻害的根本办法。随着基因工程的发展， 在树木的抗寒性研究方面取得了进展。本文就结构基因、顺式作用元件、转录因子和转基因技术在林木抗寒中的应用与研究进展进行了阐述， 以期为林木抗寒相关研究提供参考。
1 结构基因
结构基因是一类编码蛋白质的基因， 大多数真核生物的基因是不连续基因。所谓不连续基因就是指基因的编码序列在DNA分子上是不连续的， 被非编码序列所隔开。编码的序列称为外显子， 是一个基因表达为多肽链的部分；非编码序列称为内含子， 又称插入序列。内含子只转录， 在前mRNA时被剪切掉。一些抗寒相关的结构基因， 通过转录形成RNA， 再通过翻译形成相关的蛋白质， 进而表现出抗寒的特性。2003年， 李春霞从胡萝卜中克隆得到抗冻蛋白基因， 并转入山杨， 得到转基因植株后经PCR检测获得1株卡那霉素的转基因株系， 结果表明目的基因AFP基因已被整合进山杨基因组中[1]。2007年， Benedict等将拟南芥抗寒相关基因CBF1基因转化到杨树基因组中， 并证明该基因的成功表达可提高杨树的抗寒性。
2 顺式作用元件
顺式作用元件， 位于结构基因的旁侧， 包括启动子、增强子、应答元件。它是转录因子的结合位点， 并通过这种结合进而调控下游基因转录， 确保转录的精确起始和转录效率。目前此方面在林木中研究较少， 相对滞后。此外， Li等[2]研究表明不同基因启动子对抗逆基因的表达作用不同， 其中cor15基因启动子要弱于cor15b基因启动子对抗逆基因表达活性的影响， 此外还发现这种影响不仅与顺式作用元件种类有关， 也与其数量密切相关。Khurana等[3]发现CCAAT—box和HSEs作为小分子热激蛋白sHSP26启动子中重要的热激元件在表达调控中起了决定性的作用。
3 转录因子
转录因子即能够结合在基因上游的特异核苷酸序列上的蛋白质， 并能调控该基因的转录。转录因子可以调控核糖核酸聚合酶 （RNA聚合酶， 或叫RNA合成酶） 与DNA模板的结合。同时在与该基因上游的`启动子区域结合的同时， 转录因子还可以与其他一些转录因子形成转录因子复合体， 进一步影响基因的转录， 进而影响蛋白质的合成。2014年， 罗梦雪等[4]从麻疯树基因组中克隆到一个CBF2基因 （命名为JcCBDF2） 。运用生物信息学的分析手段对该基因序列及其编码的蛋白质序列进行了分析， 结果表明， JcCBDF2蛋白中不止包含AP2/EREBP保守的结合结构域， 还具有CBF转录因子特征序列。实时荧光定量结果显示基因主要在麻疯树叶片内转录表达， 对低温胁迫极其敏感， 初步研究表明基因是低温诱导型转录因子。赵天田， 王贵禧， 梁丽松等[5]根据平榛花芽转录本高通量测序的结果， 采用RACE—PCR技术克隆到平榛S4OQ基因， 并对基因进行实时荧光定量表达分析， 表明：平榛雌花芽中的表达量最高， 随后表达量逐渐下降， 在不同器官中的表达具有差异性， 雄花序中表达量最高。杨杞， 白肖飞， 高阳等[6]以沙冬青为试验材料， 利用RT—PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列， 并对其进行了序列分析， 运用生物信息学预测其编码的氨基酸序列具有CBF家族基因特有的AP2结构域。为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因。
4 其他
4。1 小G蛋白基因
小G蛋白分子量约为20—30KD具有GTP酶活性， 在多种细胞反应中起开关作用。当小G蛋白与GTP结合时成为活化形式， 作用于下游分子并将其活化。当GTP水解成为GDP时， 小G蛋白恢复为非活化状态。黄亚成等[7]从橡胶树胶乳cDNA文库中克隆1个小G蛋白的基因全长， 进行了聚类和表达分析， 采用实时荧光定量的方法研究该基因低温处理下的表达水平。结果显示4℃低温胁迫下该基因在橡胶树幼苗根中的表达明显受诱导且在胁迫初期表达最强， 后又有所下降， 为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
4。2 microRNA
microRNA （或miRNA） 是指参与转录后基因的表达调控， 由内源基因编码的非编码单链RNA分子， 长度约为22个核苷酸。目前， 关于MicroR—NA的调控机理还不太清楚。2012年， 张译云[8]以毛白杨为材料， 进行不同时间段 （0、8、14、20h） 的低温胁迫 （4℃） 处理， 分别提取小片段RNAs （<200nt） ， 利用实时定量PCR技术研究毛白杨在低温胁迫后12种miRNAs的差异表达规律。结果显示， miRNAs的表达在低温胁迫下有显着变化， 且呈现动态反应。在低温胁迫下， 大部分miRNAs的表达受到抑制。miR168a、miR169ac、miR394a—3p、miR530a的表达量在各个时间段显着下调。表明， miRNAs在调控毛白杨对低温胁迫的反应中起着重要作用。2012年， 张译云以毛白杨为试材， 通过构建microRNA的cDNA文库， 经高通量测序获得144个保守microRNA和29个新microRNA， 并用生物信息学方法预测了新microRNA的101个靶基因， 且这些靶基因均与植物生长或逆境胁迫密切相关。该研究对进一步探讨microRNA在毛白杨经低温胁迫后的调控机制具有重要意义。
5 林木抗寒展望
目前， 抗寒性研究是林业抗逆性研究中重要一项， 并已深化到基因水平。虽然转基因技术存在一定的争议而且植物抗寒性状作为质量性状多受多基因控制， 抗寒分子机制相对复杂， 目前对这方面的研究仍不够透彻， 经基因转化获得的抗寒性植株还有很大的盲目性。但利用转基因技术增加林木抗寒性， 并不涉及食品安全问题， 同时一些寒冷胁迫应答基因已陆续被鉴定， 很多关键基因已通过转基因技术成功提高了林木的抗寒性。近年来， 在大数据时代的潮流中， 基因芯片、转录组等高通量生物技术的成功应用进一步加快了抗寒相关候选基因的鉴定， 因此运用基因工程技术改善植物抗寒性将拥有越来越好的前景。
参考文献
[1]冯连荣， 宋立志， 林晓峰。杨树抗寒育种研究进展[J]。防护林科技， 2010 （1） ：92—94
[2]Li F， Han YY， Feng Y， et al。Expression of wheat expansin driven by the RD29promoter in tobacco confers water—stress tolerance without impacting growth and development[J]。Biotechnol， 2013， 163 （3） ：281—291
[3]Khurana N， Chauhan H， Khurana P。Wheat chloroplast targeted sHSP26promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenic Arabidopsis plants[J]。PLOS One， 2013， 8 （1） ：e54418
[4]罗梦雪， 高继海， 时小东， 等。麻疯树耐冷基因JcCBF2的克隆及表达模式分析[J]。四川大学学报， 2014， 51 （6）
[5]赵天田， 王贵禧， 梁丽松， 等。平榛ChWRKY2转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析[J]。林业科学研究， 2012， 25 （2） ：144—149
[6]杨杞， 白肖飞， 高阳， 等。沙冬青CBF/DREB1转录因子的cDNA克隆及序列分析[J]。基因组学与应用生物学， 2009， 28 （6） ：1043—1048
[7]黄亚成， 秦云霞， 刘林娅， 等。橡胶树HbRAN1基因的克隆与表达[J]。热带作物学报， 2013， 34 （7） ：1257—1263
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