三、农杆菌Ti质粒基因转化机理
1. T-DNA的加工及转移
首先在下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3’端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。
VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分别编码16KD和47KD蛋白，与T-DNA的加工有关，决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。 VirD2蛋白的功能：①特异剪切，并与T链的5’端共价结合。②导向功能；
2.T链蛋白复合体的形成及VirE的功能
T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。
T链以一种DNA-蛋白复合体（T复合体）的形式存在。
目前已知至少两种Vir特异蛋白即VirE2和VirD2与T链蛋白复合体的形成有关。
VirE2的功能：编码ssDNA结合蛋白，该蛋白可非特异地一与任何ssDNA结合，通过与T链非共价结合，VirE2可包被T链形成细长的核-蛋白丝，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和内切核酸酶。
3、T链复合体通过细菌细胞膜的转运及VirB的功能
（1）VirB的功能
VirB启动子有11个基因，大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白，能在膜上形成一种类似细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必须的结构——接合孔或性毛。T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞。同时，VirB也可能起运输和提供能量的作用。 按功能，可将VirB蛋白分成五类：
R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体；
A：此类蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促进T复合体被泵出细菌细胞，VirB11可能是这种A类蛋白。
C：形成通道的作用，如：VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。
S：载体蛋白，起运载T 复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有膜成分（内膜、外膜及周膜）有关。
P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。
（2）T复合体向植物细胞核的转运
VirD2可能以一种极性方向，将T复合体定向至核孔，而VirE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。 在T-DNA转移过程中，VirD2具有火车头的作用，牵制T复合体以5’端到3’端的方向向核迁移，而VirE2则只助推器的角色，帮助未折叠的长形T复合物不被打断，并方便其向核运动。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒内切酶的作用，如核酸外切酶VII对VirE2-ssDNA降解能力将相当于对ssDNA的6%，对S1核酸酶的效果也相似。
4、细菌染色体上与T-DNA转移有关的基因
目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关，它们主要涉及细菌与植物细胞的接触和细菌向植物伤口的趋化性。
chvE——编码一个葡萄糖和半乳糖结合蛋白，主要结合组成植物细胞壁的单糖；可能由于识别植物受伤产生的糖单体，导致细菌向植物伤口的趋化性；在低pH值、磷酸饥饿条件下启动VirG表达。
chvD——编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值、磷酸饥饿条件下诱导VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信号，刺激VirG转化成活性形式，启动其他VirG 基因表达。
chvA 、chvB、 chvC——与环状?-1，2-葡聚糖的合成和运输有关； chvB产物催化合成葡聚糖， chvA产物将多糖从胞质运到胞外，影响农杆菌对植物细胞的附着能力。
pscA和Exoc——与多糖的合成有关，并影响农杆菌对植物细胞的附着能力。
四、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
1、野生型Ti质粒直接作为基因工程载体的障碍：
（1）分子量大，160~240Kb；
（2）有各种限制性内切酶的多个切点；
（3）T-DNA区中含有许多编码基因与基因转移无关，如致瘤基因，其存在还会导致植物体丧失形态发生能力；
（4）Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。
2、Ti质粒构建的几个重要因素
（1）右边界序列；
（2）完整的Vir基因群；
（3）有独特的酶切点；
（4）有在植物中可表达的选择性基因；
（5）有在细菌中可表达的选择性基因；
（6）章鱼碱型农杆菌品系需要独特的增强子。
3、载体构建
先将T-DN段克隆到大肠杆菌质粒中，并插入外源基因，最后通过三亲交配或接合转
移把外源基因引入农杆菌Ti质粒上。
Ti质粒的载体系统分两类：一元载体和双元载体
例：双元载体的构建
双元载体系统由两个分别含T-DNA和Vir区的相容质粒构成。
（1）构建原理
Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移，T-DNA和Vir区处于不同的Ti质粒上同样能起到转移T-DNA的作用。
双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起点（oriv），从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区，它们能在任何农杆菌寄主里自发复制。所以寄主仅需一套完整的vir质粒就可。主要的转移区载在小重组Ti质粒上。
（2）微型Ti质粒（mini-Ti plasmid）
含有T-DNA边界，缺失Vir基因的质粒；含广谱质粒的复制位点OriV及选择标记基因。
（3）辅助Ｔｉ质粒
含Vir区段的Ti质粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突变型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的转移。
LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生质粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更强的毒性。
五、根癌农杆菌侵染植物细胞的机理
1、根癌农杆菌的生物学特性
分类
农杆菌属，也称土壤杆菌属和根瘤菌属，是同属于根瘤科的革兰氏阴性菌。
土壤杆菌属有4 个种：根癌农杆菌、放射形农杆菌、毛根农杆菌和悬钩子农杆菌。
根癌农杆菌，根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型即章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。
生活习性
土壤杆菌属都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中，好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长，最适温25~30℃，pH4.0~12.0,最适pH6.0~9.0。 形态结构
农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛运动，不形成芽孢，菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范围
根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具敏感性，能诱发肿瘤，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。
2、根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理
（1）酚类化合物
酚类物质——农杆菌浸染植物细胞所必需的'诱导物，同时将其作为趋化物来识别。 实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、β-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。
Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可诱导Vir活化。
（2）中性糖和酸性糖
中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，
发现许多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖）都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。
酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖（胡萝卜根提取物中蒸馏出来）可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。
（3）pH值
5.0~5.5的低pH值。诱导物对pH的要求是<.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物（AS）的培养基中时，pH5.0 ~5.8Vir的诱导达到一个最高水平
3、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性
（1）常用的根癌农杆菌
胭脂碱型（Nop）菌株：染色体背景为C58，生长快，不结球，转化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。
章鱼碱型（Oct）菌株：染色体背景为Ach5，生长慢，结球，转化中难操作，培养后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。
农杆碱型（Agr）菌株，也称琥珀碱型（Suc）：染色体背景为A281或A136，具有胭脂碱型菌株的特点，以A136为染色体背景的常用菌株是EHA101，生长快，不结球，侵染能力强，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。
（2）、根癌农杆菌的侵染能力差异
根据侵染能力大小将农杆菌分为：
广宿主菌株：大多数双子叶、若干裸子植物、少量单子叶植物；如：pTiB0542、pTiA6； 窄宿主菌株：有限的几种植物上诱发肿瘤，如pTiAg162,仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤。 不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，在转化中，二者的选配十分重要，要选农杆菌与植物之间有高侵染力的配合。如：杨树茎，用C58优于LBA4404；苹果，6种基因型比较，叶：EHA101（pEHA101）优于LBA4404，C58；茎：A281优于C58，ACH5，A348。
农杆菌的染色体背景对宿主范围同样有着重要作用。因为除Vir区功能外，农杆菌对植物表面识别与结合有关的功能还取决于农杆菌染色体上基因位点。农杆菌所展示出不同的生长速率、多糖产生和对植物细胞的毒力都会影响转化率和宿主范围。
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