植物基因工程课件(3)

六、根癌农杆菌转化程序及操作原理

　　1、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序

　　（1） 选择适宜的培养基，使创伤部位能产生尽可能多的再生植株。

　　（2） 确定供体植物最适的培养条件。

　　（3） 确定最佳外植体类型、大小、部位等：再生途径，愈伤组织起源（细胞类型、层次），

　　保证转化愈伤组织和芽原基由创伤部位的浅层细胞发育而来。

　　（4） 确定适宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制细菌生长，还能保证愈伤组

　　织正常生长和分化。

　　（5） 确定选择压力的最低水平。

　　（6） 优化农杆菌接种和共培养条件改进筛选条件，促进抗性细胞恢复再生能力：采用无毒的生化物质。

　　2、根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备

　　（1）农杆菌的培养

　　常用的农杆菌培养基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培养基。

　　这些培养基中，LB、YEB、YEM及523属富集培养基，其营养成分丰富，包括有各种有机成分。在这些培养基中农杆菌生长快，分裂旺盛，它们是常用 制备工程菌液的培养基。 ? PA和 TY培养基是属营养较好的培养基，氨基酸及碳源、氮源都很丰富。农杆菌在这些培养基上生长也很快，是常用的农杆菌选择培养时的培养基。

　　MinA培养基与前几种培养基有明显差异：只提供必要的无机盐，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。

　　Minimal只用相应的冠瘿碱如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和无机氮作为农杆菌的碳源和氮源。

　　农杆菌在MinA和Minimal培养基上生长较慢。在进行三亲杂交时通常用这两种培养基，并加相应的抗生素选择转化的农杆菌。含重组质粒的大肠杆菌及含辅助质粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠瘿碱作为碳源和氮源而不能生长，同时还存在抗生素的选择，因此有利于选择转化的农杆菌的生长。

　　农杆菌的生长周期

　　农杆菌培养方式：分为固体平板培养和液体振荡培养，

　　固体培养一般需2～3d，液体培养生长更快，一般需1～2d。

　　农杆菌接种在培养液后，并不立即开始增殖。一般在25～30℃时，需1～2 h细菌才开始分裂。

　　当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供氧缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。

　　当细菌密度达到 177／ml时，空气中的氧气便难以很快地扩散到细胞内。在振荡或通气条件下培养，细菌浓度也很少超过 2～3 X 109／ml。

　　测定农杆菌浓度的方法：最简单的方法是光密度测定法。将菌液装入比色杯汽在分光光度计上选用600nm波长测定其OD值。光密度与浓度换算公式是1OD约等于 8 X 108／ml。

　　（2）工程菌的纯化

　　纯化菌种的方法主要采用常规的微生物纯化方法，即划线法。用接种针划线，然后用石蜡膜封口，将平皿倒置放恒温箱内，在25～28℃条件下培养过夜，次日或即日看到分离的单菌落。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养。

　　（3）工程菌侵染悬浮液的制备

　　液体振荡培养的工程菌，通常培养 12～24 h后即可达到对数生长期。用离心管取一定数量的菌液进行4000r／min离心，倒掉上清液，再加入植物外值体诱导愈伤组织或分芽的液体培养基，使其光密度OD值达到0．5，即可用作接种外植体的工程菌液。

　　注意：因为农杆菌培养基中通常含有抗生素，它对外植体的生长、脱分化或分化有不良影响，放需通过离心除去细菌培养基，加入植物培养基。也有的做法是，将农杆菌加入植物培养基后再振荡培养 12 h，当细菌生长达到对数生长期后再离心，倒掉上清液，用新的植物液体培养基稀释至一定OD值，再作为工程菌液使用。

　　（4）工程菌的保存

　　菌种的保存的目的是创造一个适合细菌休眠的环境（低温、干燥、缺氧），使其得以长期保存。其功能在于尽量减少菌株的传代次数；使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率；最终目的是的基因不能丢失。

　　菌种保存的方法根据其保存时间长短可分为三种方法：

　　短期保存〔数月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌种置于4℃可保存数月，平板用石蜡膜密封后也可在低温0～4℃下放置数月。

　　中长期保存（数年）：中长期保存采用穿刺法，这是一种菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基，用接种针沾取少量问后直接插入柱状培养基中。需注意的是，要从培养基中间插入，直插到接近管底，但不要穿透培养基，再慢慢按原途径拔出接种针，切勿搅动，以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，而影响保存效果。穿刺培养的菌种用蜡封口，在室温下可保存数年。

　　长期保存菌种：主要采用甘油保存法。在7％二甲基亚（DMSO）或 15％甘油中，菌种可于- 70℃冰箱或液氮中长期保存。当甘油含量增加40～ 50%时，细菌可在- 20℃或- 70℃条件下，保存若干年而不失活。将冰冻菌种从冰柜中取出时，应当放在冰浴上慢慢融化，不可直接将其放室温下，否则会导致菌体失活，更不能直接接种至液体培养基内28℃振荡培养。

　　3、Vir基因活化诱导物的使用

　　（1）诱导物：

　　常用诱导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－AS），其中效果优是AS。但最近又有新的发现，有两种特殊化合物比AS的诱导活性高10～100倍。

　　（2）诱导物的使用方法

　　在农杆菌液体培养时加 AS，加入时间－般在制备工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力。也有的在农杆菌悬浮液离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入。

　　AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。共培养的过程是Ti质粒实现 T-DNA转化时期。一般农杆菌附着 16 h后才能进行转化，这时需要vir基因的高度活化。因此，许多科学家赞成这种使用方法。

　　在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠，只不过是使用的AS诱导剂太多了。

　　（3）诱导物使用的pH值

　　pH值对vir区的活化有着明显的影响，从理论上讲含AS的培养基pH值为5．0～5．6时， Vir区基因的诱导达到最高水平。

　　pH值改变 0．3，即对多种植物的转化率有明显影响。

　　章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低的pH值。

　　通常农杆菌培养时pH值为7．2。这种生长旺盛的菌株的vir基因均处于不活化状态。而组织培养基中的pH值常为5．8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应调整培养基的pH值。

　　4、外植体的选择

　　Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。

　　（1）外植体的种类

　　叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块；茎尖分生组织、芽、根、合子胚或体细胞胚，以至成熟的种子等都可作为外植体转化。但各种外植体材料的转化率有明显差异。

　　最佳共培养的时间：

　　农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T－DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于 16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。共培养时间对转化率有着很大影响，而且不同物种、外植体种类、农杆菌菌株的最佳共培养时间不同。

　　确定最佳共培养时间的方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，统计瞬时表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑外植体的受损害程度，以保证外植体的旺盛生长为直。最后还要以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。

　　农杆菌的增殖适度

　　在共培养时农杆菌增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，则转化的机率很小。反之，农杆菌在外值体四周过度增殖，可引起对外植体的毒害，致使其褐化死亡。 控制农杆菌增殖适度的原则是既要使菌株在外植体边缘特别是切口面旺盛增殖生长，又不应过度，一般以覆盖切口面为适度。 控制农杆菌增殖的方法有以下几种：

　　1）调整工程菌液的浓度，生长太快则应降低菌液浓度。

　　2）控制共培养时间，农杆菌的增殖生长适度也是确定共培养最佳时间的指标，共培养时间太长可造成农杆菌过度生长。

　　3）使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。一种方法是在共培养基中加入适量的抗生素如羧苄青霉素或头孢霉素。另一种方法是共培养2～3d后的外植体需用含抗生素的液体共培养基充分洗涤，以除去过量的农杆菌，然后转到新鲜的共培养基上继续共培养。共培养结束时若仍存在农杆菌过度增殖，则可再用上述洗涤培养基充分洗涤后进行愈伤组织诱导或不定芽分化培养 。 共培养中激素的影响

　　共培养时培养基中是否加激素，文献报道不一，有的不加激素，有的则认为加激素后促进外植体细胞分裂，保持细胞活力，也有利于转化后细胞的生长，从而提高转化率。

　　如 Mansur等（1993）用 A281菌株与花生叶片外植体共培养时，加激素比不加激素的肿瘤诱导率提高约 30％。

　　目前大多数研究者采用加激素的方法，而且共培养基与愈伤组织诱导或不定芽诱导培养基相同。

　　（4）外植体脱菌及选择培养 外植体的脱菌培养 脱菌培养，即把共培养外植体转移到含有抗生素的培养基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（Carb）、 头孢霉素（Cef） 等。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑菌作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效但对不同植物的不同外植体产生的影响不同。

　　Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物为生长素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈伤组织的增殖。Howe 等（ 1994 ）观察到对杨树的愈伤组织诱导有抑制作用。在甘蓝研究中发现，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化阶段需用Carb， 生根阶段则用Cef。 抗生素的使用浓度一般为500mg／L 左右。其使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。

　　脱菌培养的时间：脱菌培养的时间，一般需5～6次继代培养，但仍然不能把残留的农杆菌杀死，特别是共生在维管束和细胞间隙中的农杆菌。如果停止使用抗生素后的外植体又有农杆菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到试管苗形成。

　　（5）转化体的选择培养

　　?选择压： 选择抗生素如 Km，加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，

　　称之为选择压。加入的抗生素浓度愈大，选择压也愈大。选择培养基中抗生素的浓度，即选择压的强度，也要根据植物的特性而定，较敏感的植物要用较低的 Km浓度。一般浓度范围是 Km 50～ 100mg／L， hpt 10~20mg／L， ppt 5～20mg／L。

　　?选择的方法：前期选择、延迟选择和后期选择。

　　前期选择：就是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，相当于前面讲到的先选择后再生。

　　延迟选择：当愈伤组织和不定芽诱导培养时开始不加选择压，过一周或一定时间后再加入选择压，这样既有利于转化细胞生长又不会产生更多的嵌合体 后期选择：即相当于前面说的先再生后选择，有利于提高转化率。

　　选择培养过程中转化和再生细胞的一致性

　　在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转化，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。因此再生部位和可被转化的细胞部位应该发源一致，反之得到的可能是假转化体。假转化体在继代选择培养基上生长不良而死亡，或呈白化。