七、根癌农杆菌Ti质粒转化的方法
1、整体植株接种共感染法
该途径是模仿农杆菌天然的感染过程，人为地在整体植株成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植株体内，杆菌在植株体内进行侵染实现转化，获得转化的植物细胞，因此也称之为体内转化。为了获得更高的转化频率，一般采用无菌的种子实生苗或试管苗。它是最简便的转化法。
优点：
实验周期短；
充分利用了这些无菌实生苗的生长潜力；避免在转化中其他细菌的污染；菌株接种的伤口与培养基分离，以免农杆菌在培养基上过度生长，允许在无抗生素的培养基上进行；
具有较高的转化成功率。
缺点：
转化组织中常混有较多未转化的正常细胞，即形成严重的嵌合体； 需要大量的无菌苗材料； 转化细胞的筛选比较困难。
2、叶盘转化法
（1）叶盘法转化的操作
打孔器从消毒叶片上取得叶圆片
叶盘在过夜培养的对数生长期的农杆菌的菌液中浸数秒种后，置于培养基上共培养 待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌。
同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择，3~4周培养可获得转化的再生植株。
优点：操作简单、重复性高、适用性广 （2）转化苗的保持与繁殖
主要采用两条途径实现转化苗的保持与繁殖。
营养繁殖途径，它包括试管苗的无性快速繁殖及嫁接、扦插等田间的无性繁殖方式。 该途径保持繁殖转化苗时应注意如下：
①正确使用激素浓度，低水平的激素能有利于保持外植体活力，并刺激休眠侧生分生组织的发育及侧枝形成。适当提高分裂素浓度有利于芽的分化，形成原始转化苗的无性系克隆。因此可根据实验目的选择细胞分裂的浓度。
②为消除残留的农杆菌在繁殖培养基中加入抑菌抗生素是明智的种子繁殖：
这对于转基因植株的正常表达、遗传特性及向生产化过渡具有重要作用。该途径的主要操作是将转化试管苗在小花盆中移栽成活，然后转入田间，开花时套袋隔离防止杂交授粉及向环境中释放转化的花粉。结种后注意收割种子，保存。
3、原生质体共培养转化方法
（1）操作步骤：
①从叶片分离原生质体，在26t下暗培养24 h，然后转移到2000lX下继续培养48h；
②在细胞即将分裂，新的细胞壁物质已经形成时，加入活化的农杆菌悬浮液。农杆部原生质体的比例以1：1000左右为宜。共培养约2～3 d；
③再加入选择标记的抗生素对转化体进行选择培养约3～4周后可产生肉眼可见的小块转化愈伤组织；
④将小块愈伤组织转移到固体培养基上再生愈伤组织，此时继续保持选择压力，以便保证只有转化愈伤组织才能不断生长；
⑤将转化愈伤组织转入固体分化培养基，获得转化再生植株。其他步骤与叶盘法相同。
（2）原生质体共培养法的优点及一些技术问题原生质体的密度一般以105～106个／ml为宜。
在农杆菌和原生质体共培养期民农杆菌附着在原生质体上，超过32小时之后方可除菌洗涤，也就是要有一定的附着时间。
原生质体出现新形成的细胞壁物质是农杆菌转化的基本条件，这是因为细胞壁物质与农杆菌的附着有关。未形成新细胞壁物质的原生质体没有农杆菌的附着，也没有转化进行。 在共培养过程中，某些二价阳离子（Mg2+）为农杆菌的附着和转化所必需。二价离子的整合物EDTA可以抑制农杆菌对植物细胞壁的吸附及转化作用，因为上述 Mg2+（不是 Ca2+）与农杆菌附着到植物细胞壁有关。 共培养转化似乎是在单细胞或二细胞阶段发生，因此获得的转化愈伤组织大部分是来自一个细胞。
八、 癌农杆菌转化系统的评述
优点：
成功率高，效果好。该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，不管是用菌株接种整体植物的伤口，还是直接侵染离体培养细胞，通常都可以获得满意的转化频率。
在所有的转化系统中，Ti质粒转化系统是机理研究得最清楚的，方法最成熟，应用也最广泛。
Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DN段插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T－DNA完整地转移到植物细胞中。
T－DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物细胞中表达。
可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各种测器官中特异性表达，例如在果实中表达，在叶中表达，甚至仅在根中表达，即可进行人为地控制。
农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。
缺点：根癌农杆菌Ti质粒载体系统作为一个植物基因转化载体系统的不足之处是它主要用于双子叶植物，如何扩大其应用范围如禾谷类、裸子植物等，一直是人们所关心问题。
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